細胞遺傳學實驗方法-淋巴細胞微核測定

一 、淋巴細胞分離

分離使用Ficoll-Paque密度梯度分離淋巴細胞 。將血液用磷酸鹽緩衝鹽水按 1:1 稀釋 ，並在 Ficoll-Paque 上分層 ，血液 + PBS: Ficoll 的比例保持為 4:3 。血液在室溫下以 1800 rpm 離心 35 分鍾 。去除淋巴細胞層（血沉棕黃層）並在 PBS 中以 1200 rpm 洗滌兩次 ，每次 10 分鍾 ，然後用培養基 RPMI 1640 洗滌 。用血細胞計數器計數細胞密度 。

二 、培養條件

淋巴細胞在 15 ml 錐形聚苯乙烯離心管中的 5% CO2 加濕培養箱中於 37o 培養 。通常 ，每個培養物由 2 毫升培養基中的 1x10 6 個細胞的初始密度組成 。培養基由補充有 10% 胎牛血清 2mM L-穀氨酰胺 、100 單位/ml 青黴素 、100 ug/ml 鏈黴素和 1.5% 植物血凝素的 RPMI 1640 組成 。

在起始後 44 小時將微核測定細胞鬆弛素 B 加入到培養物中 。細胞鬆弛素 B 阻止細胞完成胞質分裂 ，導致多核細胞的形成 。細胞培養物中細胞鬆弛素 B 的最終濃度為 3 mg/ml 。

在培養開始後 72 小時 ，使用細胞離心機 (Shandon, Sewickley, PA) 將淋巴細胞直接離心到載玻片上。然後將細胞以 600 rpm 的速度旋轉到載玻片上 10 分鍾 。在室溫下甲醇固定 15 分鍾之前 ，讓載玻片風幹 。載玻片在-20℃ 下儲存在密封盒中 ，在 N2 下幹燥 。

三 、細胞染色與微核測定

染色 ：將甲醇固定的載玻片在含有 0.1% Tween 20 的 PBS 中孵育 5 分鍾。從載玻片中排出多餘的液體 ，並用含有 0.2% Tween 20 的 PBS 1:1 稀釋 40-50 ul 抗動粒抗體應用% Tween 20 。然後將載玻片蓋上蓋玻片並置於 37oC 的加濕室中 1 小時 。在含有 0.1% Tween 20 的 PBS 中洗滌兩次 ，每次 5 分鍾後 ，再次排出多餘的液體 ，用 1:50 稀釋的熒光山羊抗人 IgG覆蓋載玻片並再次孵育 1 H 。因為熒光標記的抗體暴露在光線下會褪色 ，此步驟和所有後續步驟應在黃燈下進行 。將載玻片在加 0.1% Tween 20 的緩衝液中衝洗兩次 ，並在抗褪色溶液中用 4'6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (2 ug/ml) 複染 。

細胞微核

對於淋巴細胞微核測試 ，對 1000 個雙核淋巴細胞（那些經曆了一次有絲分裂分裂的細胞）進行檢測 ，每個重複培養物中的 500 個細胞 ，用於計算微核的數量 。通過切換到熒光濾光片來確定動粒點的存在與否 。

檢測標準如下 ：

1) 細胞應具有完整的細胞質的圓形或橢圓形外觀

2) 細胞核應同樣為圓形或橢圓形 ，具有完整的核膜

3) 隻有經曆過一次核分裂的細胞才應檢測微核的存在

4) 僅當微核大小為主核的三分之一或以下時才應計數

5) 微核的染色應與主核相似

6) 微核應與主核明顯分開。

細胞染色

複製指數 (RI) ，細胞分裂動力學的量度 ，通過計算每個樣本 400 個總細胞中含有 1 、2 、3 或更多細胞核的細胞百分比 ，從對微核進行檢測的相同載玻片上進行檢測 。複製指數RI 計算如下 ：

RI = (1x% 單核細胞) + (2x% 雙核細胞) + (3x% tri) + (4x% 四核細胞）……

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