MTT實驗最全指南

一 、MTT是什麽

MTT是一種粉末狀化學試劑 ，全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide ，漢語化學名為 3-(4 ，5-二甲基噻唑-2)-2 ，5-二苯基四氮唑溴鹽 ，商品名 ：噻唑藍  。是一種黃顏色的染料 。

二 、MTT法用來做什麽

簡單地說 ：是一種檢測細胞存活和生長的方法 。

MTT主要有兩個用途 ：

1.藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對體外培養的細胞毒性的測定;

2.細胞增殖及細胞活性測定 。

三 、為何MTT可以用來做上述工作

檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)並沉積在細胞中 ，而死細胞無此功能 。二甲基亞碸(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚 ，用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值 ，在一定細胞數範圍內 ，MTT結晶形成的量與細胞數成正比 。根據測得的吸光度值(OD值) ，來判斷活細胞數量 ，OD值越大，細胞活性越強(如果是測藥物毒性 ，則表示藥物毒性越小) 。

四 、實驗所需材料

1.MTT 溶液的配製

通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑 。

市麵上一般MTT的包裝為100mg,250mg或1g

1.1對於100mg這樣的小包裝 ，廠家都是將MTT放入小管中的 ，個人建議不要再用天平稱量分裝 ，而應該一次性將其全配製成溶液 ，如100mg用20mlPBS來溶解 。 具休做法 ：預先在50ml離心管(沒有的話 ，可用培養瓶替代)加入20ml PBS ，從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中 ，吹打若幹次後將其移入50ml離心管 ，然後再混勻 。可以重複幾次 ，以使小管中的MTT不殘留於管內 。將MTT完全混勻後 ，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液裏的細菌 ，分裝避光(避光袋或是黑紙 、錫箔紙包住)可長期保存於-20度 。按細胞培養板每孔需加10ul計算 ，一般每96孔板約需1ml ，所以分裝時可考慮每管分裝1ml 。

1.2對於大包裝 ，可按上述方法稱取一部分溶解 ，也有人將粉劑分裝在EP管裏 ，用的時候現配 ，直接往培養板中加 。

注意事項 ：

在配製和保存的過程中 ，容器最好用鋁箔紙包住 。

配成的MTT需要無菌 ，MTT對菌很敏感

MTT一般最好現用現配 ，過濾後4度避光保存兩周內(個人曾做過4度避光保存4周的MTT溶液 ，效果仍然不錯)有效 ，或配製成5mg/ml保存在-20度長期保存 ，避免反複凍融 ，最好小劑量分裝 ，用避光袋或是黑紙 、錫箔紙包住避光以免分解 。當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用 。

MTT有致癌性 ，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.

2. MTT甲瓚溶解液

2.1二甲基亞碸DMSO ，可以直接溶解 ，無需配製 ，使用方便，溶解速度快 ，但對人體毒性較大，且需去除原培養液 ，在去除培養液的過程中 ，可能會把結晶去掉 ，導致結果不穩定 。

2.2三聯溶解液 ：SDS10g ，異丁醇5ml ，10M HCl 0.1ml 用雙蒸水溶解配成100ml溶液(文獻方法 ：周建軍等 ，評價抗癌物質活性的改良MTT方法 ，中國醫藥工業雜誌 ，1993 ，24(10) ：455-457) ，該溶解液不需去除原培養基 ，但溶解較慢 。(個人覺得其溶解的能力不如DMSO強)

該溶解液因含有SDS ，在低溫保存的時候易產生結晶 ，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫 ，將SDS結晶全部溶解後再使用 。

五 、MTT法實驗步驟

1: 胰酶消化對數期細胞，終止後離心收集 ，製成細胞懸液 ，細胞計數調整其濃度至5-10×104/ml 。

細胞詳細計數方法請參照易生物實驗技術中的相關文章 。對於初學者而言 ，要使細胞達到5-10×104/ml往往不知從何處著手 ，我在這裏向大家提供一個簡單的方法以初步確定細胞數量 。

以一般細胞培養常用的25cm2為例 ，

1)細胞密度在長到約80%~90%(下圖所示為80%~90%密度時細胞的大致狀態) ，消化離心收集後 ，將上清去掉 ，加入3ml培養基使其混勻。

2)另取一支新的15ml無菌離心管(為下一步接種96孔板用) ，裝入約9ml培養基.

3)從第一步準備的3ml細胞懸液中取1ml, 加入上管 ，混勻後細胞計數 ，此時一般為或小於5-10×104/ml ，該濃度相當於細胞計數板4個大格內每大格平均5-10個細胞(見下圖);如果不夠該濃度 ，再根據計數的結果滴加細胞懸液 ，每滴按50ul計算 。

4)細胞數量因實驗目的不同應做相應調整 ，如一般細胞增殖實驗每孔2000個就可以(相當於細胞懸液密度為2×104/ml) ，細胞毒性實驗每孔5000—10000個(相當於細胞懸液密度為5×104/ml) 。此外 ，還應根據細胞本身特性 ，如生長快慢 ，來決定細胞數量 。比如 ：生長較快的細胞密度可略小 。

2.將細胞懸液製備好後 ，輕輕混勻 ，每孔加入100ul, 這樣待測細胞的密度為5000—10000/孔(邊緣孔用無菌PBS填充) 。

注意 ：因細胞在混勻後仍要繼續沉降 ，因此接種的過程中要反複多次混勻 ，如每加6個孔就混勻一次 ，以確保接種的細胞密度在各孔之間完全相同 ，這對於MTT的結果至關重要 。

3.將接種好的細胞培養板放入培養箱中培養 ，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上 ，細胞貼壁後即可加藥 ，或兩小時 ，或半天時間 ，但我們常在前一天下午鋪板 ，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個複孔.建議設6個 ，否則難以反應真實情況 。

對於加藥 ，有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中 ，以形成濃度梯度 。但本人認為應盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好 ，然後將96孔板中的培養上清去掉(可以用排槍吸走)再加入100ul含不同濃度藥物的培養基 ，這樣能保證藥物濃度的準確 。另外 ，需注意的是，如果用這種方法 ，不要把96孔板的培養液全部吸走後再加藥 ，應該吸完一部分後立即加樣 ，避免由於96孔板幹燥引起細胞死亡 。

4.5%CO2 ，37℃孵育16-48小時 ，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果 。下圖為一典型的藥物梯度為細胞的毒性作用 。

5.每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml ，即0.5%MTT) ，繼續培養4h 。若藥物與MTT能夠反應 ，可先離心後棄去培養液 ，小心用PBS衝2-3遍後 ，再加入含MTT的培養液

6. 終止培養 ，準備溶解結晶 。

溶解結晶的方法有兩種 ，第一種 ，用DMSO溶解

1) MTT加入培養4h後 ，結晶可充分形成 。將上清去掉 ，該過程要注意不能把Formazan結晶移走 。有人直接用移液器將上清移走 ，也有人建議先鋪幾張濾紙在桌麵 ，然後將96孔板輕輕倒置，這樣上清便被濾紙吸走 ，以減少結果的損失 。個人認為 ，這兩種方法都有可能導致結晶的損失 ，從而引起結果的不準確 。采用哪種方法 ，可以自己摸索一下再決定 。

2) 每孔加入150ul二甲基亞碸 ，置搖床上低速振蕩10min ，使結晶物充分溶解 。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值 。

另一種方法 ，用三聯溶解液(見上麵MTT甲瓚溶解液)

1) MTT加入培養4h後 ，結晶可充分形成 。這種方法細胞上清可以不用去掉 ，直接在每孔加入100ul溶解液 。(該溶解液因含有SDS ，在低溫保存的時候易產生結晶 ，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫 ，將SDS結晶全部溶解後再使用 。)

2) 放入培養箱中繼續孵育4—6小時 ，鏡下觀察 ，待結晶全部溶解後570nm測吸光度 。通常37℃孵育4小時左右 ，紫色結晶會全部溶解 。如果紫色結晶較小較少 ，溶解的時間會短一些 。如果紫色結晶較大較多 ，溶解的時間會長一些 。

在實際的操作過程中 ，往往為了等待4—6小時 ，使得實驗者在下班以後或者晚上來測OD值 ，給實驗者帶來了很大的不方便 。個人曾經摸索 ，加入溶解液後過夜再測對OD值基本無影響 ，但要注意的是一定要避光 ，不過培養箱關閉後本身就是閉光的 ，所以加入溶解液後放入培養箱中，第二天上班時再測OD值就可以了 。

7 、同時設置調零孔(培養基 、MTT 、二甲基亞碸) ，對照孔(細胞 、相同濃度的藥物溶解介質 、培養液 、MTT 、二甲基亞碸) 。

六 、MTT結果分析

關於如何計算IC50

1 、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg 最大劑量

I:lg(最大劑量/相臨劑量)

P:陽性反應率之和

Pm:最大陽性反應率

Pn:最小陽性反應率

舉個例子 ：各藥物濃度作用於某腫瘤細胞後所得MTT值如下

公式中的最大最小陽性反應率就是最大最小抑製率

抑製率=1-加藥組OD值/對照組OD值 ，如對於100ug/ml的藥物 ，其抑製率=1-0.080/0.614=0.869 ，各組抑製率如下 ：

代入計算公式 ：

Pm=0.869

Pn=0.135

P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142

Xm=lg100=2

lgI=lg100/50=0.301

lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655

IC50=45.186

該藥物的IC50值為45.186ug/ml