人外周血調節性T細胞鑒定方案
CD127 VS Foxp3
雖然Foxp3是目前公認的調節性T細胞最特異的指標 ,但因其位於細胞內 ,使得Foxp3的染色必須要固定細胞並破核膜 ,因此這種方法並不適用於分離活的Tregs ,且該方法比較傳統 ,操作相對複雜 ,稍有不慎就會影響實驗結果 。
而CD127屬於細胞表麵Marker ,無需固定破膜 。因此 ,當前主流方向是通過CD127來檢測人Tregs 。
CD127的發現
CD127是2006年被發現的一種檢測CD4+CD25+調節性T細胞的新指標 。由於不需要將細胞固定破膜處理 ,檢測起來要比Foxp3方便 。
研究發現 ,CD4+CD25+純化的細胞中 ,CD127與Foxp3的表達呈負相關 。通過CD4+CD127low純化出的CD4+CD25+ T細胞 ,與Foxp3純化的CD4+CD25+ T細胞數量相似,並且這部分細胞展現了CD4+CD25+調節性T細胞的典型特征 。CD4+CD25+CD127-/low是較CD4+CD25+Foxp3+更優的特異性檢測Tregs的表麵標記分子 。
配色方案
人Treg鑒定所需流式抗體
人Treg鑒定所需輔助試劑
樣本管設置
實驗步驟
1 、在離心管內加入100μL新鮮血 ,與2mL 1×ACK紅細胞裂解液混勻 ,4℃裂解10min ;
2 、300g離心5min(裂解完立即離心 ,防止時間過長損傷細胞) ,棄掉上清 ,用移液槍輕輕吸走殘液 ,可以得到白色的細胞沉澱 ;
3 、加入100μL細胞染色緩衝液 ,重懸細胞 ,與流式抗體混勻 ,4℃孵育30min ;
4 、加入2mL細胞染色緩衝液 ,300g離心5min ,棄掉上清 ,再加入200μL細胞染色緩衝液 ,重懸細胞 ;
5 、上機進行檢測 。
實驗結果
人外周血Treg細胞表型分析
解析 :
熒光素間有溢漏 ,故需要設置單陽管 ,用於調節補償 ;
本實驗取正常人外周血驗證 ,無生物學對照 ;
增加CD45指標 ,便於淋巴細胞圈門 ;
圈門路徑 :
第一步 ,根據CD45和SSC-H ,圈出淋巴細胞群 ;
第二步 ,利用FSC-H和SSC-H ,去黏連 ,得到單細胞 ;
第三步 ,通過CD3 ,確定CD3+ T細胞 ;
第四步 ,通過CD4和CD8 ,得到CD4+輔助T細胞 ;
第五步 ,通過CD25+CD127-/low ,確定出Treg細胞亞群 。
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