原代細胞培養方法
原代細胞的培養方法
原代細胞的培養方法
原代細胞的培養也叫初代培養 ，是從供體取得組織細胞在體外進行的首次培養 ，是建立細胞係的第一步 ，是一項基本技術 。原代細胞因剛從組織中分離開 ，生物學特性未發生很大變化 ，仍保留原來的遺傳特性 ，也最接近和反映體內生長特性 ，適宜用於藥物敏感性試驗 、細胞分化等實驗研究 。原代細胞往往有多種細胞組成 ，比較混雜 ，即使從形態上為同一類型(上皮樣或成纖維樣) ，但細胞間仍有很大差異 。如果供體不同 ，即使組織類型 、部位相同 ，個體差異也照樣存在 ，原代細胞生物特性尚不穩定 ，如需做較為嚴格的對比性實驗研究 ，還需進行短期傳代培養 。
1 、組織塊培養法
組織塊培養是常用 、簡便易行和成功率較高的原代培養方法 ，也是早期采用培養細胞的方法 ，故原先被稱為組織培養 。其方法:為將剪成的小組織團塊接種於培養瓶(或皿)中 ，瓶壁可預先塗以膠原薄層 ，以利於組織塊粘著於瓶壁,使周邊細胞能沿瓶壁向外生長 ，方法簡便 ，利於培養 ，部分種類的組織細胞在小塊貼壁24小時後細胞就從組織塊四周遊出 ，然後逐漸延伸 ，長成肉眼可以觀察到的生長暈 ，5～7天後組織塊中央的組織細胞逐漸壞死脫落和發生漂浮 ，此漂浮小塊可隨換液而棄去 ，由組織塊周圍延伸的貼壁細胞也逐漸形成層片 ，可在顯微鏡下觀察形態和用於實驗研究 。其培養方法如下:
(1)按照前述方法取材,將組織剪成或切成1mm3大小的小塊 ，並加入少許培養基使組織濕潤 。
(2)將小塊均勻塗布於瓶壁 ，每小塊間距0.2cm～0.5cm ，一般在25mL培養瓶(底麵積為17.5cm2)可接種20～30小塊為宜，小塊放置後 ，輕輕翻轉培養瓶 ，使瓶底朝上 ，然後於瓶內加入適量培養基蓋好瓶塞 ，將瓶傾斜放置在37℃溫箱內 。
(3)培養24小時 ，待小塊貼附後 ，將培養瓶緩慢翻轉平放，靜置培養 ，動作要輕 ，嚴禁搖動和來回振蕩,以防由於衝動而使小塊漂起而造成培養失敗 ，若組織塊不易貼壁可預先在瓶壁塗一薄層血清 、胎汁或鼠尾膠原等 。開始培養時培養基不宜多 ，以保持組織塊濕潤即可 ，培養24小時後再補液 ，培養初期移動和觀察時要輕拿輕放 ，開始幾天盡量不去搬動 ，以利貼壁和生長 ，培養3～5天時可換液 ，一方麵補充營養 ，一方麵去除代謝產物和漂浮小塊所產生的毒性作用 。
2.消化培養法
該方法是采用前述的消化分散法 ，將妨礙細胞生長的細胞間質(包括基質 、纖維等)去除 ，使細胞分散形成細胞懸液 ，然後分瓶培養 。某些特殊類型細胞,如內皮細胞 、骨細胞等的消化手段和步驟，將在有關章節中敘述 。
3.懸浮細胞培養法
對於懸浮生長的細胞 ，如白血病細胞 、淋巴細胞 、骨髓細胞 、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無需消化 ，可采用低速離心分離,直接培養,或經淋巴細胞分層液分離後接種培養 。
4.器官培養
器官培養是指從供體取得器官或組織塊後 ，不進行組織分離而直接在體外的特定環境條件下培養 ，其特性仍保持原有器官細胞的組織結構和聯係 、並能存活 ，器官培養的目的和技術均與單層細胞培養不同 ，但可利用器官培養對器官組織的生長變化進行體外觀察 。並觀察不同培養條件研究對器官組織的影響 。器官培養可保持器官組織的相對完整性 ，可用於重點觀察細胞間的聯係 、排列情況和相互影響 ，以及局部環境的生物調節作用 。體外器官培養為臨床上的器官移植創造了便利的條件 。器官培養的條件與細胞培養不同 ，要有特殊的要求 。
1. 器官培養的特殊的要求
(1)需要特殊的培養條件因器官離體培養 ,其營養和氧氣僅靠自然滲透來供給 ，因此 ，培養時為了確保中心不發生缺乏氧和營養而造成壞死 ，其厚度或直徑不宜超過1mm 。
(2)器官內部細胞需要有足夠的氧氣滲入常采用以下兩種方法:
①將器官組織塊置於培養基氣液麵以利於氣體交換 。提高培養基中的氧分壓 ，一般需加注純氧 ，提高氧分壓時仍需保持5%C02 ，以維持pH 。
2. 器官培養的方法
(1)將不鏽鋼網做成的支架 ，放置於培養皿中 ，高度為1/2 皿高 ，使其表麵鋪上0.5mm孔徑的濾膜 。
(2)將培養基加入平皿中,使培養液剛剛接觸到濾膜,但不要使濾膜浮起 。
(3)將要培養的器官組織平放在濾膜上，-般厚度不要超過200μm ，水平麵積不超過10mm2 ，如為肝 、腎不能大於1mm2 。
(4)將培養物置於CO2培養箱內 ，並加注氧氣 ，調整氧分壓達90% ，培養時注意使液麵與膜保持在一致的水平上 。
(5)上述器官培養1～3周(每隔2～3天換液一次)後可用於實驗和檢測 。
原代細胞的培養與維持
(一)原代細胞培養
1 、靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養)
凡經消化液處理實體組織來源的細胞要通過充分漂洗 ，以盡量除去消化液的毒性,細胞接種時濃度要稍大一些 ，至少為5×108細胞/L ，培養基可用Eagle (MEM)或DMEM培養 ，小牛血清濃度為10%~80% ，有條件的應在37℃ 5% CO2的培養箱中培養 ，在起始的2天中盡量減少振蕩,以防止剛貼壁的細胞發生脫落 ，漂浮 。若原代貼壁細胞不是用於長期培養 ，隻是用於分離繁殖或測定病毒之用 ，其細胞濃度可以加大 ，盡量貼成厚層以利病毒的效價提高和測定結果(如空斑)更加明顯 、準確 ，待細胞基本貼壁伸展並逐漸形成網狀,此時的pH若有明顯變化,應將原代細胞換液 ，即倒去舊液,換入新鮮的培養基,以便除去衰老 、死亡的細胞和陳舊的培養基 ，使貼壁細胞能獲得充足的營養 。若用骨髓或外周血中的懸浮細胞經靜置培養1周時 ，可有少量的肌樣纖維間質細胞或基質細胞開始貼壁生長,為了利於該貼壁細胞充分貼壁和生長 ，此時換液應將細胞懸液經低速離心後 ，按半量換液方式棄去舊液加入新液 ，然後再將細胞懸液放入原瓶中繼續培養 ，經反複幾次換液後,貼壁肌樣細胞逐漸形成網狀 ，此時換液可將原懸浮細胞和培養基移入另一新瓶 ，然後分別補加新鮮培養基(也按半量換液方式分別對半加入新液)繼續培養 ，原瓶的貼壁細胞逐漸長成單層 ，而新瓶中又會出現二次貼壁細胞 ，經幾次換液也會逐漸長成單層,在此類細胞培養時 ，培養基中往往需加入少量的維生素D3 、 bFGF 、地塞米鬆 、小牛血清(濃度要在20%以上) ，以利細胞貼壁生長 。
2 、懸浮細胞的培養
凡來自外周血 、胸腹水 、脾髒 、淋巴結 、骨髓的淋巴細胞 、造血幹細胞以及白血病細胞,在原代培養時要盡量去除紅細胞 。若作用於試驗的短期培養 ，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養基中進行培養,細胞濃度可在5～8×109/L範圍內 ，然後進行分瓶試驗 。若要將淋巴細胞及白血病細胞進行長期培養 ，淋巴細胞中要加入生長因子,白血病細胞中要加入少量的原患者血清，以利細胞生長 ，待細胞開始增殖甚至結成小團塊 ，培養基中pH變酸 ，說明細胞生長繁殖良好 ，-般每隔3天需半量換液一次(換液時盡量使細胞不丟失) ,待細胞增殖加快 ，濃度明顯增加 ，pH發生明顯變化時 ，此時可考慮傳代 。但千萬不能急於傳代 ，一定要待細胞密度較高時才能進行 ，以防傳代失敗 。
(二)原代細胞的維持
1 、貼壁細胞(包括半貼壁細胞的換液)
貼壁細胞長成網狀或基本單層時 ，由於營養缺乏 ，代謝產物增多 ，pH 變酸 ，不適宜細胞生長 ，此時細胞還未長成單層 ，未達到飽和密度 ，仍需繼續培養 ，因此 ，需采取換液方式來更新營養成分以滿足細胞繼續生長繁殖的需要 。其換液方法比較簡單 ，即棄去舊液 ，加入與原培養液相同的等量完全培養基 。若希望細胞能在較長時間內能維持存活 ，但不需增殖 ，此時要換成含2%小牛血清的維持液 。
2 、懸浮細胞
凡經培養後隻在細胞培養基中懸浮生長而不貼壁的細胞 ，需在倒置顯微鏡下方可觀察到細胞的形態和生長現象 ，淋巴細胞的短期培養無需換液 ，但加入生長因子或有絲分裂源(PHA 、PMA 、COnA 、PVM 、LPS等)後 ，細胞不僅會發生轉化而且會發生分裂繁殖 ，此時培養基中的營養成分並不能維持細胞的營養需求 ，加之代謝產物增多 ，pH變酸 ，細胞不適宜生長 ，需進行換液 。白血病細胞或淋巴瘤細胞體外長期培養時 ，都需換液培養，待達到飽和密度時才能傳代 。換液時 ，隻能采用半量換液的方式 ，千萬不能采取倒去舊液加入新液的方式進行換液 。半量換液的方法如下:將原培養瓶豎起 ，在30分鍾內,若細胞沉於瓶底 ，可用吸管輕輕吸去一半 ， 上清棄去 ，再加入等量的新鮮完全培養基 。若細胞不能沉於瓶底 ，可吸出細胞懸液 ，采用低速離心( 1000r/min 10min)棄去一半上清加入等量的新鮮完全培養基 ，混勻後再轉入原瓶繼續培養 。
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