細胞培養中常見的汙染情況
細胞培養中常見的汙染情況
常見的汙染如下 :
1 、細菌 :細菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀 ,根據感染細菌的不同 ,可有不同的外形 ,培養液一般會渾濁變黃 ,對細胞生長影響明顯 。仔細檢查一下器皿的滅菌情況 ,是否在高壓滅菌時放氣時間足夠 ,壓力足夠 !尤其是和儲存培養液接觸的移液管等物品 ,連續兩次汙染的話有可能造成儲存液汙染 ,一定要注意 !下次使用前檢查一下培養液是否存在渾濁的現象 !可在培養液中加相應的抗生素處理 。
2 、黴菌 :培養液是清亮的 ,倒置顯微鏡下無雜質 ,37℃孵箱培養2-3天 ,仍清亮 ,但出現絮狀雜質 ,鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物 ,可看到明顯的菌絲 ,細胞仍可生長 ,但時間長之後 ,細胞的活力狀態變差 ,用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內 ,再把水盤裏也加上飽和量的硫酸銅 。或者在培養箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止黴菌汙染 。CO2孵箱被黴菌汙染後 ,可把所有細胞暫時轉移 ,采用過氧乙酸擦洗孵箱(包括隔板 ,箱壁) 。並把過氧乙酸放置在孵箱內一個小時 ,使其蒸汽彌漫 。待過氧乙酸的氣味消散後 ,再移入細胞 。孵箱應定期清潔(2月左右) ,尤其在多雨的季節 。其它培養箱清洗方法是 :用84消毒液擦洗-清水擦洗-75%酒精擦洗-紫外燈照 。預防黴菌汙染 ,可在培養基裏加3u/ml的兩性黴素或製黴菌素或放線菌素D或雙抗 ;但細胞一旦汙染 ,很難挽救 ,製黴菌素或放線菌素D或雙抗都於事無補 ,建議舍棄該汙染細胞 ,將環境徹底消毒 ,如果所有細胞都汙染 ,可能是係統汙染 ,檢查一下培養基和器材 ,如果隻是個別汙染 ,可能是操作問題 ,就要注意操作 。
3 、支原體 :黑色的,好像多為多形 ,培養液一般培養液一般會渾濁 ,原體感染 ,國內血清很多都沒有做支原體陰性檢測 ,而支原體是牛血清中最常見的微生物之一 。而且它不能用過濾的辦法除去 。支原體感染細胞以後 ,細胞病變不很明顯 ,隻是慢慢死去 。用泰樂菌素 ,獸用支原體病的藥 ,但可用於細胞培養 ,無任何不良反應 。Sigma公司的使用時用50ug/ml Tylosin培養液培養6天或連續傳兩代即可清除支原體汙染 。如果作為常用的抗生素的話, 建議用8ug/ml的濃度 。
4 、黑蛟蟲 :可以穿透濾膜 ,也可以通過空氣傳播 ,低倍下為黑色點狀 ,高倍下可看見黑色的小蟲遊來遊去 ,培養液也是不渾的 ,一般不會太影響 ,細胞還是可以用的 。常常是細胞生長狀態良好 ,且觀測到的運動物無明顯增多 ,且培養液顏色 、透明度無明顯變化 ,可在同一批號的血清養的細胞中發現類似現象 。對細胞生長狀態不會有明顯影響 ,在細胞增殖旺盛之後會自然消失 ,除更換血清外無須特殊處理 。建議如果細胞有可能是此種汙染的話 ,可以增加細胞的種板密度 ,以提高細胞的生存率 。
5 、真菌 :一般培養液清亮 ,不變色 ,鏡下有絲狀物 ,有些真菌開始很像死細胞碎片 ,隻是它很多很多的小塊很清楚 ,像珊瑚狀 ,不像細胞碎片分不清 ,慢慢的會長出很細的黑色絲狀物 。真菌生長的比較慢 ,不像細菌那麽容易被發現 ,但是一旦發現有它的存在細胞就被汙染了 ,也很難救活了 。
6、原蟲 :培養液可輕微渾濁 ,顯微鏡下那些細小的點狀物數量非常多 ,輕微活動 ,細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢 ,而且細胞狀態不好 ,邊緣不清楚 ,細胞不透亮 。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養 。這種共生是非常普遍的 ,但他們的數量小 ,細胞站優勢所以不會影響到細胞的正常生長 ,隻有當他們到達一定的數量時就會影響到細胞的生長,最終形成惡性循環。
汙染的可能原因 :可能原因很多比如配液消毒問題 、操作問題 、環境問題等等
關於培養基的無菌狀況 ,取培養基至培養瓶中(不加細胞) ,37℃試培養一段時間後觀察 。如果沒有細菌生長 就是操作的問題 。也可以在培養基中事先加入雙抗(硫酸鏈黴素和氨苄青黴素) 。但雙抗有時會影響細胞的狀態 ,所以在做轉染 、檢測細胞某項指標前一定要撤去雙抗 ,以避免影響實驗結果 。
1 、孵箱應定期用三氧機消毒或者紫外光照射 ,並用酒精和新潔爾滅試擦孵箱同時孵箱內的水應是三蒸水 。
2 、超淨台 、取材 、器材 、培養液 、培養瓶 、操作等因素 。
3 、超淨台的風機不能過大 ,風機到6-8格 。否則也可能能致黴菌汙染 。
4 、無菌室經甲醛熏蒸消毒後 ,可用同等量的氨水噴灑中和 ,約幾小時即可進入操作 。
關於黑膠蟲 :根據平時的操作 ,我覺得“黑膠蟲”有沒有可能是以下操作細節方麵的問題導致的呢 ?
1 、有時候血清瓶或者培養瓶上用標記筆寫的字沒有擦掉就直接泡酸,字跡溶解後沉積在酸缸中浸泡的瓶子裏衝洗不淨 。
2 、過火的時候不小心碰到酒精燈的燈芯 ,粉塵飛進培養液內 。
3 、有的同學習慣將移液管塞棉花的一端在酒精燈上焚燒一下 ,灰燼飛進培養液內 。
汙染後(1)
汙染後(2)
染色後
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