【主題學習】細胞實驗總結

2021-08-05 13:00:04 藍冠娛樂生物 408

MTT原理 ：MTT是一種檢測細胞功能的方法。細胞在活化增殖的過程中，線粒體的能量代謝能夠把MTT代謝為藍紫色的甲臢，甲臢沉積於細胞內或細胞周圍，形成甲臢的量與細胞活化的程度成正比，通過鹽酸異丙醇或其他溶劑溶解甲臢，用酶標儀測溶液的光密度就可以反映甲臢的量並從而判斷細胞活化增殖的程度。

步驟：
1 、培養好細胞種板。
養細胞沒啥好說的，如果不知道細胞如何養，那就看看相關的文獻方法。如果知道了細胞的名字，就可以上www.atcc.org檢索細胞的培養信息，這個網站上的培養方法是標準培養方法。當然可以根據自己實驗要求進行修改。由於細胞計數很繁瑣，種板時的細胞濃度是最難掌握的，這一點筆者的心得如下：
自己先將細胞養一段時間，大概了解細胞的增殖情況，在MTT檢測時實際上要求細胞大概能長滿96-孔板的80-90% ，如果打算養48小時就檢測，根據細胞的生長情況反推種板時的細胞濃度狀況。這時可以將細胞不進行計數，將消化好的細胞混勻後（可能是10ml）直接在一個廢棄（最好進行過無菌處理）的96孔板中依次加入180 、100 、50微升細胞，將細胞放置幾分鍾就會沉到板底了，這時在顯微鏡下觀察，推測哪個孔的細胞48 h能基本長滿板底，假設50微升的孔比較合適，而種板時每孔需點200 微升，那麽就將細胞濃度再稀釋4倍就可以正式種了，這時順便將細胞進行計數（因為實驗記錄要求寫啊）。這樣就OK了！如果細胞還太多，將細胞稀釋4倍後再重複以上操作。注意：不要過分信賴細胞計數，因為細胞計數的取樣量為20 微升左右，由於顆粒的分布不均勻，代表性是很差的。建議：細胞計數一定要會，但不要完全依賴它。
種板時一定要將細胞消化成單個細胞，而且一定要混勻，最好用排槍，否則，MTT的SD會狂大！

2 、種板布局。
其實這一點很多人不懈一顧。如果你的細胞要養48 h或更長，建議不要吝嗇96-孔板的四周邊孔，這32個邊孔不能使用，建議加入滅菌PBS以飽和中間64個孔的水分。因為細胞培養過程中，邊孔的水分蒸發很快，培養液及裏麵的藥物會出現濃縮現象，細胞的狀況就複雜了，有些人稱之為“邊緣效應”這些孔的SD也會狂大，既然如此，不如不用。

3 、將培養板取至無菌區域操作。

4 、加入MTT溶液，使其占培養基體積的10% ，MTT終濃度為5mg/ml 。（培養基無酚紅）
注：加MTT的時候建議熄滅酒精燈，反正無菌無所謂了，還有我做MTT時，濃度1mg/ml都有結果，避光冷藏一周內用完
如果確認你考察的藥物沒有氧化還原性，你可以直接加入MTT溶液（總體積的1/10），如果你沒有把握，建議在加MTT前換一次液；如果你肯定考察的藥物的氧化還原性很強，比如穀胱甘肽、Vit E 、VitC ，那建議你用PBS將細胞洗洗，否則這些藥物會將MTT還原成棕褐色沉澱，這種效果可能是你不需要。

5 、將培養板放回培養箱，孵育4h（有1-4h,3-4h等說法）。

6 、孵育期結束後，將培養板從培養箱中取出，溶解藍紫色產物甲臢（formazan)
A 、如果是貼壁培養的細胞，去掉培養基，加入MTT溶解液，量等同於原來培養基的體積。1h內上機檢測。
注：MTT溶解液可以是酸化異丙醇（0.1N HCL+無水異丙醇）或是DMSO
注：我覺得最好不要用PBS洗了，會損失紫色結晶的。我以前是一孔一孔的吸的，很麻煩而且會損失結晶，現在我去掉96孔板的蓋子，鋪幾張濾紙在96孔板上，小心的翻過板來，孔中的液體會流出來，且不會損失肉眼可見的結晶。
B 、如果不是貼壁培養的細胞，則直接加入MTT溶解液。

7 、在搖床上輕搖有助於甲臢的溶解，上下吸取（碾碎）可能可以完全溶解甲臢，尤其是在高密度。

8 、上機檢測：
雙波長法：為了數據準確可以采用雙波長法，雙波長法是采用兩束不同波長的光，一束測量樣品稱測定波長（λS）；另一束作為對照，稱參比波長（λR）。兩束光交替照射到斑點上，以吸收度之差ΔA定量。雙波長可以消除酶標板不均勻的影響，使基線變得平穩。測定波長一般選測定組分的最大吸收波長，參比波長可選在組分無吸收的位置。這樣可以增大ΔA 。做MTT可以分選570 am實驗波長和630 Bm參考波長在酶標儀上讀出每孔光吸收值。個人認為，用酶標板檢測時，幹擾因素應該是不大的，可以用單波長檢測。
在理想的MTT實驗中，如果是細胞抑製實驗，不加藥物處理組的吸收值應該在0.8-1.2左右，太小檢測誤差占的比例較多，太大吸收值可能已經超出線性範圍。這個原理在朗伯-比爾定律中有解釋。
備注：做MTT時應該有調零孔，對照孔，加藥孔。調零孔加培養基、MTT 、二甲基亞碸，用來調零。對照孔和加藥孔基本是一樣的，都要加細胞、培養液、MTT 、二甲基亞碸隻不過對照是加配藥時的介質，而加藥組加不同濃度的藥。