如何做好細胞克隆形成

(一)實驗目的

通過細胞在細胞培養板上的克隆形成能力來提示細胞的增殖能力 。

(二)實驗原理

克隆形成是測定細胞增殖能力的有效方法之一 。單個細胞在體外持續6代以上 ，其後代所組成的細胞群稱為克隆 。這時每個克隆含有50個以上的細胞 ，大小在0.3-1.0 mm之間 ，通過計數克隆形成率 ，可對單個細胞的增殖潛力做定量分析 ，了解細胞的增殖能力和獨立生存能力 。

(三)實驗流程

(四) 實驗材料

生物安全櫃 、熒光顯微鏡 、離心機、倒置顯微鏡 、CO2培養箱 ；

完全培養基 、胰酶 、PBS 、結晶紫 、4%多聚甲醛 。

(五)實驗步驟

1.  準備感染後細胞[如果是克隆形成預實驗 ，直接用空細胞進行實驗]  ：將處於對數生長期的各實驗組細胞胰酶消化 ，完全培養基重懸 ，製成細胞懸液 ，計數 。

吸棄培養基

PBS清洗

加入胰酶

終止消化

收集細胞

離心獲取沉澱

細胞計數

2.  細胞接種 ：於6孔板培養板中各實驗組接種500-1000個細胞/孔[正常增殖速度為1:5-1:10傳代 ，3天長滿細胞 ，可以接種500個細胞 ，其餘增殖緩慢細胞 ，可以接種800-1000 ；接種時注意梯度稀釋細胞懸液 ，觀察細胞密度 ，以免因計數不準確導致實驗結果偏差]  ，每個實驗組設3個複孔 ，培養基為含30%FBS的完全培養基 ；

鋪板

鋪板後搖勻

3.  將接種好的細胞搖勻後輕放於培養箱中繼續培養 ，每隔3 天進行換液並觀察細胞狀態 ，顯微鏡下觀察克隆大小[3複孔之間克隆大小應相似]  ，待單個克隆生長到大小不超過圖片視野時可以進行拍照 ；

4.  拍完照之後的將6孔板放入培養箱中繼續培養 ，待孔中大多數單個克隆中細胞數大於50為止 ，棄上清 ，PBS洗滌細胞1次 。

5.  每孔加入1 mL 4%多聚甲醛[有毒 ，注意在安全櫃中操作]  ，4度冰箱固定細胞60 min ，PBS洗滌細胞1次 。

加入多聚甲醛

6.  每孔加入潔淨 、無雜質結晶紫染液1000 μL ，染細胞2min 。

7. ddH2O洗滌細胞數次 ，晾幹 ，數碼相機拍照整 ，克隆計數。

吸棄染液

加入超純水清洗

晾幹

拍攝

(六) 吉凱結果

1. 數碼照相機拍攝結果

2. 熒光顯微鏡拍攝代表性克隆結果

(七) 實驗操作參考文獻

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